Amikor a COVID-19 betegséget okozó vírus világszerte elterjedt, a Nemzetközi Atomenergia Ügynökség az Egyesült Nemzetek Szervezetének Élelmezésügyi és Mezőgazdasági Szervezetével összefogásban felajánlotta támogatását és szakértelmét az országoknak, hogy használni tudják a valós idejű reverz-transzkripció polimeráz láncreakciót (valós idejű RT-PCR-t) az egyik legpontosabb laboratóriumi módszert a koronavírus tanulmányozására, követésére, kimutatására.

De mi is az a valós idejű RT-PCR? Hogyan működik? Hogyan kapcsolódik a nukleáris technológiához? Itt most a módszer rövid praktikus összefoglalóját adjuk az Ön kezébe, amelyben elolvashatja, hogy mi is ez a módszer, valamint néhány részletet a vírusokkal és a genetikával kapcsolatban.

Mi az a valós idejű RT-PCR?

A valós idejű RT-PCR egy nukleáris eredetű módszer, amely arra szolgál, hogy kimutassa valamilyen kórokozó, beleértve a vírusok sajátos genetikai anyagának a jelenlétét. Eredetileg a módszert radioaktív izotóp markerként alkalmazták, azért, hogy célzott genetikai anyagokat mutassanak ki, aztán a finomítások eredményeként az izotóp jelölőket különleges markereke, leggyakrabban fluoreszkáló festékre cserélték. Ennek a módszernek a segítségével a tudósok szinte azonnal látják az eredményeket, még a folyamat közben; míg a hagyományos RT-PCR-nél csak akkor, amikor a folyamat befejeződik.

Bár a valós idejű RT-PCR jelenleg a legszélesebb körben alkalmazott módszer a koronavírus kimutatására, mégis számos országnak még mindig támogatásra van szüksége a technika használatához.

Mi a vírus? Mi az az örökítő anyag?

A vírus egy genetikai anyagból álló mikroszkopikus csomag, amelyet egy molekuláris burok vesz körül. A genetikai anyag DNS és RNS is lehet.

A DNS egy két szálból álló molekula, amely minden szervezetben megtalálható, állatokban, növényekben, vírusokban is és a genetikai kódot hordozza;  vagyis egy program, arra vonatkozólag, hogy ezek a szervezetek hogyan épüljenek fel és hogyan fejlődjenek.

Az RNS általában egy szálas molekula, amely a genetikai kódok részeit másolja, leírja, átadja a proteineknek, melyek így összegzik és hajtják végre a szervezet életben tartásához és fejlődéséhez szükséges funkciókat. Az RNS-nek különböző változatai vannak, némelyik a másolást, másik változata a leírását, és van, amelyik az átadást végzi.

Néhány vírus, mint például a koronavírus, (SARS-Cov2) csak RNS-t tartalmaz, ami azt jelenti, hogy az egészséges sejtekbe szivárog be, azért, hogy sokszorosodhasson és a túlélhessen. Mihelyt a sejtben van, a vírus a saját genetikai kódját használja – a koronavírus esetében az RNS-t – hogy átvegye az irányítást, és „újraprogramozza” a sejtet, amely így vírusokat előállító gyárként működik.

Annak érdekében, hogy a vírusokat, így a koronavírust is már a korai megjelenésekor ki lehessen mutatni a szervezetben, a valós idejű RT-PCR-t használva a tudósoknak az RNS-t át kell alakítaniuk DNS-é. Ezt a folyamatot hívjuk „reverz transzkripciónak”. Azért kell ezt az átalakítást elvégezni, mert csak a DNS-t lehet másolni – vagy amplifikálni –, mely kulcsfontosságú a valós idejű RT-PCR vírus-kimutató folyamatában.

A tudósok az átírt vírusos DNS egy meghatározott részét több százezerszer is amplifikálják. Az amplifikáció azért fontos, mert ahelyett, hogy a tudósok elenyésző mennyiségű vírust próbálnának meg észrevenni a milliónyi genetikai információelem között, a vírusos DNS elég nagy mennyiségű célzott szakasza áll rendelkezésre ahhoz, hogy pontosan meg tudják erősíteni a vírus jelenlétét.

Hogyan működik a valós idejű RT- PCR a koronavírus esetében?

Mintát kell venni a szervezet azon részeiről, ahol a vírus összegyűlt, például az orrból vagy torokból. A mintát számos kémiai oldattal kezelik, amely bizonyos anyagokat (például proteineket, zsírokat, kivonatokat) távolít el, hogy csak az RNS maradjon a mintában. A kivont RNS az ember saját genetikai anyagának, és ha jelen van, akkor a koronavírus RNS-ének a keveréke.

Az RNS a reverz transzkipció folyamán válik DNS-sé, amely egy speciális enzim révén valósul meg. Ezután az RNS-hez a tudósok további rövid DNS töredékeket adnak, amelyek kiegészítik az átírt vírusos DNS bizonyos részeit. Ezek a töredékek maguktól kapcsolódnak a vírusos DNS célzott szakaszaihoz, amennyiben a vírus jelen van a mintában. A hozzáadott genetikai töredékek egy része az amplifikció során építi fel a DNS szálat, míg más része csak simán a DNS-t építi fel, és marker jelzőket ad a szálakhoz, ez utóbbiakat használják arra, hogy kimutassák a vírust.    

A keveréket ezután egy RT-PCR gépbe helyezik. A gép hőmérséklettel ciklizál, amely melegíti és hűti a keveréket, ezzel előidézve bizonyos kémiai reakciókat, amelyek a vírusos DNS célzott szakaszának új, azzal megegyező másolatát hozzák létre. A ciklust számtalanszor megismétlik, annak érekében, hogy folytatódjon a vírusos DNS célzott szakaszának a másolása. Minden ciklus megduplázza az előző mennyiséget: két másolatból négy lesz, négyből nyolc és így tovább. Egy szabáványos/sztenderd valós idejű RT-PCR berendezés általában 35 ciklust hoz létre, ami azt jelenti, hogy a folyamat végén a minden szálban létrejött vírusos DNS szakasznak körülbelül 35 billió új másolata lesz jelen a mintában.

Amint a vírusos DNS új másolatai felépültek, a marker jelzők kapcsolódnak a DNS szálhoz, és fluoreszkáló festéket eresztenek ki. A festéket méri a gép számítógépe és a kibocsátás idejekor megjelenik a képernyőn. A számítógép minden egyes ciklusban méri a mintában megjelenő fluoreszkáló festék mennyiségét. Ha a fluoreszkáló festék mennyisége átlép egy bizonyos szintet, az azt erősíti meg, hogy a vírus megtalálható a mintában. A tudósok megfigyelik, hogy hány ciklusnak kell lezajlania ahhoz, hogy elérje ezt a szintet, azért, hogy meg tudják becsülni a fertőzés komolyságát: a kevesebb ciklus enyhébb, a több súlyosabb vírusfertőzöttséget jelent.  

Miért alkalmazzuk a valós idejű RT-PCR-t?

A valós idejű RT-PCR technika nagyon érzékeny, speciális, és megbízható diagnózist ad három órán belül, míg a laboratóriumoknak általában átlagosan ez 6-8 órát vesz igénybe. Összehasonlítva más elérhető vírus izolációs módszerekkel, a valós idejű RT-PCR jelentősen gyorsabb, és kisebb az esély a lehetséges fertőződésre vagy meghibásodásra, mert az egész folyamat egy zárt csőben zajlik. Továbbá ez a legpontosabb elérhető módszer a koronavírus kimutatására.   

A korábbi fertőzések kimutatása, amely szintén fontos a vírus kialakulásának és elterjedésének megértéséhez, nem lehetséges a valós idejű RT-PCR-rel, mert a vírus csak egy meghatározott ideig van jelen a szervezetben. Más diagnosztikai módszerekre van szükség olyan személyek esetében, akik már túlestek a fertőzésen, főleg azok esetében, akikben kialakult és tünetmentesen terjesztették a vírust.

A NAÜ együttműködésben az Egyesült Nemzetek Szervezetének Élelmezésügyi és Mezőgazdasági Szervezetével már 20 éve képez és készít fel szakembereket világszerte a valós idejű RT-PCR használatára, főleg a VETLAB hálózatán keresztül, amely az állatorvosi diagnosztikai laborok hálózata. Manapság ezt a technikát alkalmazzák más betegségek, mint például az Ebola, Zika, MERS-Cov, SARS-Cov1 és más jelentős zoonózis és állati betegségek diagnosztizálásában. A zoonozis betegségek olyan állati betegségek, melyekkel az állatok az embert is megfertőzhetik. 

Forrás: Az eredeti cikket az RHK Kft. fordította a Nemzetközi Atomenergia Ügynökség honlapjáról. Az eredeti cikket itt találja.